作为抗凝剂的新的靶向组织因子的血栓调节蛋白融合蛋白
2020-01-06

作为抗凝剂的新的靶向组织因子的血栓调节蛋白融合蛋白

本发明涉及一种新的融合蛋白,其包含与组织因子(TF)结合的靶向蛋白,其可操纵地连接到单独的或组合有至少一种其它的TM结构域的血栓调节蛋白(TM)EGF456结构域上,其它的TM结构域选自由N末端疏水性区域结构域、EGF123结构域、EGF3和EGF4之间的域间环、O-糖基化的富含丝氨酸/苏氨酸结构域,或其类似物、片段、衍生物或变体组成的组中。所述融合蛋白结合于损伤部位并阻止血栓形成的启动。所述融合蛋白可以用于治疗多种血栓性病变,包括但不限于深静脉血栓形成、弥漫性血管内凝血以及急性冠脉综合征。

图4.scFv(TF)3e10剂量依赖性地抑制FX活化检测。在实施例5"因子X活化检测"中描述了该检测的细节。ICs。代表达到50%最大抑制所需的剂量。

图5.融合蛋白比TF抗体或单独TMi456能更有效地抑制凝血。进行凝血酶原时间(PT)检测以比较融合蛋白与TF抗体或单独的TMi456。将适当体积的浓縮的抑制物或TF抗体(scFv(TF)3e10)、TMi456或融合蛋白(scFv(TF)3elO-TMi456)加入到lOOj Q M s ii p、 A E D T A V Y C AR V Ij S 1j T D Y Y W Y G M D V W G Q G T Ij V T VS A G G G G S G A P n F M Ij T Q P H s V S A S PG K T T 工 S C T R S S G S V A S Y V Q W Y QQ r p g s s p t t V i e D n h r p 3 g v p d rf S G I D T S S A S Li t I S .g Ij k T e d eA D ■y Y C Q S D S N N V G G (3 T K Ij T V:l g a a a g a p v p y p d Ij p r a a (254) 单链抗TF抗体scFv(TF)3elO(SEQIDNO:l)由信号肽(-18到-1)、VH结构域(l到126)、VH-Vj妾头(127到131)、Vj吉构域(132到246)以及e-tag序列(247到264)组成。一实施例2融合蛋白构建体<formula>formulaseeoriginaldocumentpage51</formula> (- 18) M g V Ii V G A A Ii A G V F P E M A QV R E S G G T v Q P G G S 1/ R S C A A SG F S T D A W M S w V R Q A P G K E E W V sS I s G S G G S T Y Y A G s V K G R E1 T i s R DN S K T I< Q M N S I> R A E D T A V C A v s t d y w g m d v w g q g t i; v t vs A g g g g s g a p n f m t q p h s v S a s pg K t v T i s c t r s s g s v a s y v Q W Y qq R p g S s p t t V 工 y e d h r p s g V P d RF S G S i D T S S N S A S T I S G I; K T E d Ea d y c q s d s v v f g g g t K T vIi g A a a G G G G S G G G G S G G G G S V E P VD P C F R A N C Y Q C Q p Ii n Q T s Ii C V Ca e g a p i p ^ e p h r c q & e" c n q t a c pa d c d !> n t a s c e c p e g i i; d d g iC t d I D E C E N G G c s G v c H n :l P G T Fe c I c g p d s a i> a i g t d c a a a g a pV P P D P L E P R A A (400) 融合蛋白scFv(TF)3e10-TMi456(SEQIDNO:2)由信号肽(-18到-1)、VH结构域(l到126)、V『VL接头(127到131)、VL结构域(132到246)、VL-TM接头(247到264)、TMi456结构域(265到382)以及e-tag序列(383到400)组成。TMi456中的H381G、M388L、R456G和H457Q突变用下划线表示。实施例3融合蛋白构建体2-scFv(TF)3elO-TMi456Asc„(- 1B> M I, G V li V 1j G A Ij A A G V F E M A QV N R E s G G T V Q P G G S r S C a A sG F S F T D A W M S W V R Q a P G K E E W V' sS I S G S G G s T Y Y A G s V K G R F T I S R DN S K T Y Q M N S R A E D T A V C AR V ]j S T D W Y G M D V W G Q G T V T VS A G G G G S N F M Ii T Q P H S V S S P G K TV T I S C T R S S G S V S Y V Q W Y Q R PG S S P T T V I Y E D N H R P S G V P D R F S GS I D T S S N s A S T I S G !< K E D E A D C Q S D S N N V V F G G G t K :l t V Ii G AA A G G G G S G G G G S G G G G S V E P V D P CF R A N C E Y Q C Q P I* Q T S Y C V C E GF A p I ^ E p H R C Q F C Q T A c P A D CD P T Q A S c E C P E G Y I D D G F 工 C T DI d E C E N G G F c s G V C H N P G T E C IC G P D S A !■ A G I G T D C (379) 融合蛋白2-scFv(TF)3elO-TMi456A(SEQIDNO:3)由信号肽(-18到-1)、Vh結枸域(1到126)、VH-Vt接头(127到131)、Vt结构域132到243)、VL-TM接头(244至U261)以及TMi456结构域(262到379)组成。TMi456中的H381G、M388L、R456G和H457Q突变用下划线表示。实施例4融合蛋白在细菌/哺乳动物细胞内的表达细菌表达是可能的,但它所生成的蛋白所具有的TM辅因子活性被极大地减低。在CHO细胞中表达融合蛋白。表达质粒含有潮霉素B和DHFR选择标记。初始选择在400叫/ml潮霉素中进行以选择出一个群。然后对所得到的群进行lOOnM氨甲蝶呤选择。在这个选择期间,从群中选择出具有含有选择标记和靶向基因的DNA区域的扩增拷贝的细胞。作为选择的结果,表达水平从近0.3mg/L增加到约6mg/L。实施例5体外检测1.蛋白C活化检测(显色法)通过在微量滴度板内混合下列蛋白的每一种蛋白各20|il进行本检测:TM样品(未知的或标准的)、凝血酶(3nM)和蛋白C(1.5pM)。每种蛋白的检测稀释液为20mMTris-HCl、O.lMNaCl、2.5mMCaCl2、2.5mg/mlBSA、pH7.4。在37。C下孵育2个小时,随后加入20^1蛭素(0.16单位&1370nM)至检测稀释液并另外孵育IO分钟以终止蛋白C的活化。通过加入lOOnllmMS2266(检测稀释液)检测所形成的活化蛋白C的量,并继续在37。C孵育。用MolecularDevices读板器每10秒读取每个孔在405nrn的吸光度共30分钟。储存吸光度数据并计算出每秒钟吸光度的变化(斜率)。每秒钟吸光度的变化与pmol/ml活化蛋白C成比例。利用不同浓度的总活化蛋白C经验性地确定该比率。通过将0到1.5pM的蛋白C和60nM兔TM以及30nM凝血酶混合,孵育0到4小时,如上加入蛭素并测定S2266活性可以生成含有100%活化蛋白C的样品。100%蛋白C被活化的条件被定义为S2266活性(A405Zsec)达到平台的条件。每单位活性被定义为在上述的试剂条件下每ml/min生成lpmol活化蛋白C。或者,给出比较于天然去污剂可溶的兔TM的活性数值。2.sTF/FVIIa活化检测下面描述了本检测的原理。底物三肽p-nitroanilide的酰胺键被sTF/FVIIa复合物水解。在405nm监测所释放的生色团产物p-nitroanilide,用摩尔消光系数9920M"cm—1计算出每单位时间所形成的产物浓度。将初始速率加入到4参数方程:Y=(A-D)/(l+(x/C)AB)+D可测定出IC5o值(C)。H-D-Val-Leu-Arg-p-NA—H-D-Val-Leu-Arg+p-NAS2266底物三肽生色团试剂和溶液:1.检测缓冲液:50mMTris-HCl、150mMNaCl、5mMCaCl2、0.1%BSA,pH7.52.人FVIIa(HCVIIA-0060,HaematologicTechnologiesInc.):10x工作溶液-在使用前配成20nM检测缓冲液溶液。3.可溶性TF(Berlex):10x工作溶液-在使用前配成30nM检测缓冲液溶液。4.显色底物S2266(KabiPharmaciaHeparInc.):储存溶液:10nMH20溶液,fC下储存。2.5x工作溶液-在使用前配成2.5mM检测缓冲液溶液。5.抗体:在使用前配成2.5x检测缓冲液稀释液。检测条件:室温下在96孔微量滴度板内进行检测。各种成分的最终浓度如下:sTF3nM抗体从1000到0.625nM不等;FVIIa2nMS2266lmM检测步骤:1.将0.1ml2.5xAB(或缓冲液对照)吸入到每个孔内。2.加入0.025ml10xsTF,在室温下轻晃孵育10min。3.加入0.025ml10xFVIIa,在室温下轻晃孵育10min。4.加入0.1ml2.5xS2266底物,马上将滴度板转移到读板器并在405nm每隔10秒钟测定酶动力学共15分钟。3.因子X活化检测:下面描述了本检测的原理。将FVIIa与重组人TF小泡(vesicle)一起孵育形成能活化底物FX的蛋白酶复合物。在存在(或不存在)不同浓度的抗体时形成该复合物,然后引入底物FX,进行反应以形成产物,活化的蛋白酶FXa能水解显色底物S2222的p-nit聽ilide酰胺键。在405nm监测所释放出的生色团产物p-niti'oanilide,用摩尔消光系数9920M—'cm—H十算出每单位时间所形成的产物浓度。将初始速率加入到4参数方程:Y=(A-D)/(1+(x/C)AB)+D可测定出1(:50值(c)。Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-p-NA—Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-OH+p-NAS2222底物生色团试剂和溶液:1.检测缓冲液:50mMTris-HCl、150mMNaCl、5mMCaCl2、0.1%BSA,pH7.52.人FVIIa(HCVIIA-0031,HaematologicTechnologiesInc.):4x工作溶液-在使用前配成100pM检测缓冲液溶液。3.重组人TF(来自Innovin,Dade,在我们实验室重构):工作溶液-在使用前配成1:480检测缓冲液稀释液。4.因子X(HCX-0060,HaematologicTechnologiesInc.):4x工作溶液-在使用前配成1000nM检测缓冲液溶液。5.显色底物S2222(KabiPharmaciaHeparInc.):储存溶液:6mMH20溶液,4"C下储存工作溶液-在使用前配成0.78mM的3.57mMEDTA(用于终止反应)、150mMNaCl、50mMTris-HCl、pH7.5的溶液。6.抗体:在使用前配成4x检测缓冲液稀释液。检测条件:在室温下96孔微量滴度板内进行检测。各种成分的最终浓度如下:rTF小泡1/4的1:480稀释液;抗体从1000到0.625nM不等;FVIIa25pM;FX250nM:S22220.546mM;检测步骤:1.将0.015ml4xAB(或缓冲液对照)吸入到每个孔内。2.加入0.015ml4xrTF小泡。3.加入0.015ml4xFVIIa,在室温下轻晃孵育10min。4.加入0.015ml4xFX,在室温下轻晃孵育5min。5.加入0.14mlS2222底物,马上将滴度板转移到读板器并在405nm每隔IO秒钟测定酶动力学共15分钟。4.蛋白C活化检测(在富含TF表面)按上述的显色法蛋白C活化检测法进行本检测,除了在本检测中在添加凝血酶和蛋白C之前将含有人TF的PC/PS小泡添加到融合蛋白中。实施例6抗TF抗体的特性从完整的人单链抗体噬菌体展示文库中分离得到七种不同的TF结合抗体。用BIAcore测定的sTF结合抗体的亲和力在35和470nM之间。用sTF/VIIa检测确定抗体是否能阻断活性VIIa/TF复合物的形成。在sTF/VIIa检测中,VIIa与sTF的结合加快显色肽底物S2266的裂解速率大于20倍。抑制FVIIa与TF结合的抗体阻断了这种加速。在所分离到的七种不同的抗体中,它们中只有一种,scFv(TF)3elO不抑制sTF/VIIa检测。该抗体增加了FVIIa与sTF的亲和力,降低了KD5倍(图1)。利用sTF/FVIIa检测所测定的scFv(TF)3elO抗体对sTF的Ko值为65.4nM(图2)。用微量量热法比较scFv(TF)3e10对TF及对FVIIa/TF复合物的亲和力。这些试验发现抗体对TF/FVIIa复合物的亲和力是对游离sTF亲和力的20倍(33nM对600nM,图3)。用FX活化检测比较抗体,它由磷脂小泡中的全长TF、FVIIa和FX组成。用显色底物S2765测定所生成的FXa的量。尽管scFv(TF)3e10抗体没有BIAcore所测定的最高亲和力以及它增加了FVIIa对sTF的亲和力,但是它是这一组中唯一能抑制FX活化及在PT检测中能延长凝血时间的抗体。scFv(TF)3e10(二聚体)抗体在FX活化检测中的抑制作用的ICso为0.44nM(图4)并且在417nM时出现PT的2倍延长(图5)。依照与重组人可溶性TF的结合鉴定scFv(TF)3e10抗体。人与鼠或人与兔之间TF的序列同源性分别为58%和71%。抗体与人TF的独特表位的结合干扰了FVIIa/TF复合物对FX的活化。生理上,该抗体具有优于与FVII或FVIIa竞争结合TF的抗体的优点。人血浆中的FVII和FVIIa的KD为10nM,或比该Kd高出100倍到1000倍之间。高亲和复合物的脱离速率(off-rate)将是低的(70到700秒钟,预期K。n二108M-'sec-')。相反,FX对VIIa/TF复合物的Km为0.200到58钉iM之间以及人血浆中的FX浓度为130nM(在0.03和0.65倍KD之间)。FVIIa/TF复合物在凝血上的主要功能是将FX转化为FXa。实施例7融合蛋白scFv(TF)3elO-TMi456的体外特性在多种体外检测中评价了本发明的融合蛋白scFv(TF)3elO-TMi456的特性。融合蛋白scFv(TF)3elO-TMi456保留了抑制FVIIa/TF复合物活化FX的能力(IC5Q=0.5nM,数据未示出)以及作为凝血酶催化的蛋白C的活化的辅因子(显色检测,图6)。在缺少含TF的磷脂小泡时,在融合蛋白和单独Tmi456之间没有观察到对TM的辅因子活性的显著差异。相反,在存在含TF磷脂小泡时,融合蛋白但不是TMi456的TM辅因子活性增强了〉5倍(图7)。融合蛋白scFv(TF)3e10-TMi456抗TF诱导的凝血(PT检测、外源性凝血途径)的体外效力比scFv(TF)3e10抗体高出6倍,比单独TMi456高出17倍(图5)。相反,融合蛋白抗内源性和常见凝血途径的体外效力不受显著影响(APTT和TCT检测,数据未示出)。因此,造成PT2倍延长的融合蛋白的剂量对APTT只有轻微影响,而对PT有等价作用剂量的TMi456造成了APTT的4倍延长(图8)。这个体外数据与在血栓形成的动物模型中所预期的TF/FVIIa定向抗凝剂的结果是一致的,已知该抗凝剂在出血率上有更好的作用。与基于血浆的凝血检测一致,融合蛋白scFv(TF)3elO-TMi456比scFv(TF)3e10或单独Tmi456在TF诱导的全血凝血检测(thromboelastograph,TEG)中有着更强的作用(图9)。另外,融合蛋白sc.Fv(TF)3elO-TMi456比低分子量肝素(LMWH)在TF诱导的全血凝血检测中有更多的预期的剂量效应(图IO)。综上,上述数据说明本发明的融合蛋白在体外是有效的和选择性的抗凝剂。实施例8体内大鼠血栓栓塞模型融合蛋白scFv(TF)3el0-TMi456的TF抗体部分特异于灵长类TF。在清醒的雄性Sprague-Dawley大鼠(350-400g,n〉7/组)上用人TF(含有人重组TF的组织促凝血酶原激酶试剂,Ortho)触发形成血栓栓塞模型。在这个弥漫性血管内凝血(DIC)模型中,通过组织促凝血酶原激酶注射,TF诱导了肺内纤维素沉积、呼吸衰竭和死亡。将等摩尔量的scFv(TF)3elO-TMi456或scFv(TF)3e10或小泡注射到尾静脉内,15分钟后丸式注射(bolusinjection)组织促凝血酶原激酶(0.5ml/kg)。在载体(vehicle)治疗组中,这种剂量的TF造成了60%的死亡率(LD6()),通常发生在组织促凝血酶原激酶注射后的5分钟内。根据下面的发病率-死亡率评分系统将大鼠评分:0-不受影响;1=轻微呼吸窘迫(在30min内恢复);2=严重呼吸窘迫(垂死的,恢复需要超过60min):以及3=死亡。用平均分数比较4组不同处理组的效果。在图11中描述了利用这种体内检测方法的结果。本发明的融合蛋白在这个检测中能抑制死亡和呼吸窘迫。用通常或特殊描述的反应物和/或本发明的操作条件取代在上述实施例中所使用的反应物和/或操作条件可以重复出具有相似成功率的上述实施例。虽然本发明己经被举例说明某些融合蛋白构建体的生成,但显而易见的是在不脱离本发明的精神和范围时可以对本发明进行变化和修饰。<110><120><130><140><141><150><151><160><170><210><211><212><213><220><223>序列表舍林股份公司作为抗凝剂的新的靶向组织因子的血栓调节蛋白融合蛋白BERLX282WOPCT/US03/135222003-04-3060/376,5662002-05-013Patentlnversion3.1282PRTArtificialSequenceDescriptionofArtificialProteinSequence:SyntheticFusion<400>1MetLeuGlyValLeuValLeuGlyAlaLeuAlaLeuAlaGly510PheProGluMetAlaGinValAsnLeuArgGluSer25ValGinPro3520GlyGlySerLeuArgLeuSer40SerGlu65TyrliysPhe50ThrAspAla!LeuGluTrpValTrpMet55SerSer70SerTrpValCysArgAlaGin60lieSerGlySerGly75AlaGlySerValLysGlyArgPheThrlieSer90AsnThrLeu10085TyrAlaValTyr115TyrGly"5TyrCysMetAspValGlyGlyGlySerLeuGinMetAsnSerLeuArg105AlaArgValLeuSerLeuThr120GlyGly30AlaSer45AlaProGlySerArgAspAlaGlu110AspTyr125LeuVal15ThrLeuGlyPheGlyLysThrTyr80AsnSer95AspThrTyrTrpGly130TrpGly135GlyAla150GinGlyThrLeuValThrValSerAla140ProAsnPheMetLeuThrGin155SerValSerAlaSerProGlyLysThrValThrlieSerCys165170ProHis160ThrArg175SerSerGlySerValAlaSerTyrTyrValGinTrpTyrGinGinArg180185190ProGlySerSerProThrThrVallieTyrGluAspAsnHisArgPro195200205SerGlyValProAspArgPheSerGlySerlieAspThrSerSerAsn210215220SerAlaSerLeuThrlieSerGlyLeuLysThrGluAspGluAlaAsp225230235240TyrTyrCysGinSerTyrAspSerAsnAsnLeuValValPheGlyGly245250255GlyThrLysLeuThrValLeuGlyAlaAlaAlaGlyAlaProValPro260265270TyrProAspProLeuGluProArgAlaAla275280<210>2<211>418<212>PRT<213>ArtificialSequence<220><223>DescriptionofArtificialSequence:SyntheticFusionProtein<400>2MetLeuGlyValLeuValLeuGlyAlaLeuAlaLeuAlaGly510PheProGluMetAlaGinVal20ValGinSerGlu65TyrLysPhe50Pro35ThrGlyAspGlySerLeuAsnLeu25ArgLeu40AlaTrpMetSerTrpVal55ArgGluSerSerCysAlaArgGin60LeuGluTrpValSerSerlieSerGlySerGly7075AlaGlySerValLysGlyArgPheThr工leSer90AsnThrLeu10085TyrLeuGinAlaValTyr115TyrCysAlaArgMetAsn105ValLeu120SerLeuArgSerLeuThrGlyGly30AlaSer45AlaProGlySerArgAspAlaGlu110AspTyr125LeuVal15ThrLeuGlyPheGlyLysThrTyr80AsnSe:c95AspThrTyrTrpTyrGlyMetAspValTrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerAla130135140GlyGly145SerValSerSerProGlySerGly210SerAla225TyrTyrGlyThrGlyGlyCysPhe290SecTyr305ProHisCysAspLeuAspGlyPhe370lieCys385AlaAlaGlyGlySerSerAlaSer165GlySerVal180SerSerPro195ValProAspSerLeuThrCysGinSer245:LysLeuThr260GlyGlySer275ArgAlaAsnLeuCysValArgCysGin325ProAsnThr340AspGlyPhe355CysSerGlyGlyProAspAlaGlyAla405GlyAla150ProGlyAlaSerThrThrArgPhe215工leSer230TyrAspAlaAla<210>3<211>397<212>PRT<213>ArtificialSequence<220>ProAsnPheMet155LysThrValThr170TyrTyrValGin185VallieTyrGlu200LeuThrGinlieSerCysTrpTyrGin190AspAsn205HisProHis160ThrArg175GinArgAr—gProSerGlySerlieAspThrSerSerAsn220ValLeuGlyGlyGlyLeuLysThr235SerAsnAsnLeu250GlyAlaAlaAla265GlyGlySerVal280GluAspGluValValPheGlyGlyGly270GluProVal285AlaAsp240GlyGly255GlySerAspProCysGlu295CysAla310LeuPheTyrGinCysGinProLeuAsnGinThr300GinAlalieCysValCys375SerAla390ProValGluGlyPheAla315CysAsnGinThr330SerCysGluCys345ThrAsplieAsp360ProlieProAlaCysProProGluGly350GluCysGlu365HisAsnLeuProGlyThrPhe380LeuAlaGlyGin395ProTyrProAsp410工leGlyThrProLeuGluGlyGlu320AlaAsp335TyrlieAsnGlyGluCysAspCys彻ProArg415<223>DescriptionofArtificialSequence:SyntheticProtein<400>3MetLeuGlyValLeuValLeuGlyAlaLeuAlaLeuAla1510PheProGluMetAlaGinValAsnLeuArgGluSerGly2025ValGinProGlyGlySerLeuArgLeuSerCysAlaAla354045FusionGlyGly30SerSerPheThrAspAlaTrpMetSerTrpValArgGinAlaPro5055GluLeuGluTrpValSerSerlieSerGly6570TyrAlaGlySerValLysGlyArgPheThr8590LysAsnThrLeuTyrLeuGinMetAsnSer100105AlaValTyrTyrCysAlaArgValLeuSer115120TyrGlyMetAspValTrpGlyGinGlyThr130135GlyGlyGlyGlySerAsnPheMetLeuThr145150AlaSerProGlyLysThrValThrlieSer165170SerValAlaSerTyrTyrValGinTrpTyr180185SerProThrThrVallieTyrGluAspAsn195200ProAspArgPheSerGlySerlieAspThr210215LeuThrlieSerGlyLeuLysThrGluAsp225230GinSerTyrAspSerAsnAsnLeuValVal245250LeuThrValLeuGlyAlaAlaAlaGlyGly260265GlySerGlyGlyGlyGlySerValGluPro275280AlaAsnCysGluTyrGinCysGinProLeu29029560SerGlyGly75lieSerArgLeuArgAlaLeuThrAsp125LeuValThr140GinProHis155CysThrArgGinGinArgHisArgPro205SerSerAsn220GluAlaAsp235PheGlyGlyGlyGlySerValAspPro285AsnGinThr300SerAspGlu110TyrValSerSerPro190SerLeuVal15Thr!LeuGlyPheGlyLysThrTyr80AsnSer95AspThrTyrTrpSerMaValSer160SerGly175GlySerGlyValSerAlaSerTyrGlyGly270CysSerTyrCys240ThrLys255GlyGlyPheArgTyr!LeuCysValCysAlaGluGlyPheAlaProlieProGlyGluProHisArg305310315320CysGinLeuPheCysAsnGinThrAlaCysProAlaAspCysAspPro325330335AsnThrGinAlaSerCysGluCysProGluGlyTyrlieLeuAspAsp340345350GlyPhelieCysThrAsplieAspGluCysGluAsnGlyGlyPheCys355360365SerGlyValCysHisAsnLeuProGlyThrPheGluCyslieCysGly370375380ProAspSerAlaLeuAlaGlyGinlieGlyThrAspCys385390395

图3.微量量热法分析显示scFv(TF)3e10对sTF/FVIIa复合物的亲和力比对单独sTF的亲和力高出20倍。利用MicroCalVP-ITC设备进行等温滴定量热法。通过将超过2.3倍摩尔量的FVIIai添加到sTF形成sTF/FVIIa复合物。用尺寸排阻层析确认sTF被完全结合。对于抗体对复合物的亲和力的确定,将1.2pMsTF/FVIIa复合物加入到微量量热器孔中并将65|aMscFv(TF)3e10抗体加入到注射器中。对于抗体对单独sTF的亲和力的确定,将lOpMsTF加入到孔内并将141|liMscFv(TF)3e10加入到注射器中。用MicroCalOrigin软件进行数据分析。数据适合于单个结合位点。

图1.scFv(TF)3e10与sTF的结合增加了sTF对FVIIa的表观亲和力(apparentaffinity)。在有和无800nMscFv(TF)3e10时,利用2nMFVIIa如实施例5"sTF/FVIIa活化检测"所述进行sTF/FVIla活化检观lj。将sTF滴定到测定物中并测定出显色底物(S-2266)的裂解速率。用标准的4-parameterfit计算出sTF的表观KD。

另一方面,本发明提供了包括目标融合蛋白的药用组合物。另一方面,本发明提供了一种预防患者血栓形成的方法,包括施与上述患者治疗有效量的融合蛋白,从而抑制了凝血酶的形成而不直接影响其它的凝血参数,例如血小板的活化和聚集。

仍在另一方面,可用本发明的融合蛋白在与血液接触的医学器械表面形成一层非成血栓性包膜。

当TM定位于膜表面时,蛋白C对凝血酶/TM复合物的Km减少lO倍(Esmon,C.T.(1995)FASEBJ.9(10):946-955)。血液中的蛋白C的浓度(0.065^iM)显著地低于所报道的对可溶性TM/凝血酶复合物的Km(5pM),因此证实促凝膜表面的TM将造成蛋白C生成速率的显著的局部增强。

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